培养基的灭菌是微生物组培实验最核心的前置工序，目的是彻底杀灭培养基内部所有微生物，包含细菌真菌芽孢以及休眠孢子，避免杂菌污染后续接种培养，组培苗微生物分离纯化菌种保藏实验都离不开这一步，日常最常用方式是高压蒸汽灭菌，依靠高温高压饱和蒸汽穿透培养基，在短时间内灭活各类微生物，培养基成分复杂，含有蔗糖琼脂维生素激素等热敏物质，如果灭菌参数选择不当，会出现营养成分分解 pH 漂移凝固失败，或者灭菌不彻底仍然长杂菌的问题，培养基的灭菌不是简单加热煮沸，煮沸温度只有一百度，无法杀灭芽孢，所以不能替代高压蒸汽灭菌，操作全程要兼顾灭菌有效性和培养基成分稳定性，配好分装之后要尽快灭菌，长时间放置培养基会滋生杂菌，同时琼脂提前融化变质，影响后续使用效果。
培养基的灭菌原理与影响因素
高压蒸汽灭菌依靠密闭灭菌锅内部蒸汽升压，饱和蒸汽温度随压力上升同步升高，常规标准参数是一百二十一度，零点一兆帕，维持十五到二十分钟，这个条件可以有效杀灭耐热芽孢。灭菌效果受多个因素影响，培养基装量过大的时候热穿透速度变慢，中心位置升温滞后，同等时间下灭菌不彻底，瓶口包扎过紧或者堆叠过密，蒸汽循环受阻，冷空气没有排干净会造成实际温度达不到设定值，是灭菌失败很常见原因。热敏成分比如生长素赤霉素部分维生素，长时间高温会降解失效，这类物质一般不能和基础培养基一起高压灭菌，需要单独过滤除菌之后，等培养基降温到五十度左右再混合。培养基 pH 偏低的时候，高温对营养物质破坏更强，pH 过高也会影响琼脂凝固性能。
培养基的灭菌常用方式对照表
| 灭菌方式 | 适用场景 | 特点 |
|---|---|---|
| 高压蒸汽灭菌 | 大部分固体液体基础培养基 | 最通用，灭菌彻底，可杀灭芽孢 |
| 过滤除菌 | 含热敏激素维生素的溶液 | 无高温破坏，不能杀灭已经形成的芽孢 |
| 干热灭菌 | 培养皿三角瓶玻璃器皿 | 适合空玻璃器具，不适合含水分培养基 |
| 煮沸灭菌 | 临时简易处理 | 无法杀灭芽孢，不能作为正式培养基的灭菌 |
培养基的灭菌操作步骤
分装包扎
培养基配制完成之后分装到三角瓶或者组培瓶，瓶口用封口膜牛皮纸包扎，不要装太满，预留膨胀空间，标记培养基名称配制日期，装锅的时候瓶与瓶之间留空隙，保证蒸汽流通，不要挤压堆叠。
排冷空气
打开灭菌锅加热，等水沸腾之后打开排气阀，持续排出锅内冷空气，确认冷空气排尽之后关闭排气阀，冷空气残留会让同压力下实际温度偏低，培养基的灭菌达不到预期效果。
升压保压计时
压力上升到零点一兆帕，温度稳定一百二十一度之后开始计时，根据培养基装量调整保压时间，装量多适当延长，保压期间保持压力温度稳定，不要频繁开盖泄压。
缓慢泄压取出
保压时间结束之后，采用自然缓慢降压，不要快速急泄压，快速降压会造成培养基剧烈沸腾，冲开封口，培养基喷溅，压力归零之后再开盖取出，放在洁净区域冷却。
冷却与预培养检验
固体培养基冷却到五十度左右可以倒平板，灭菌完成之后建议放置二十四小时做空白预培养，观察有没有杂菌菌落，确认培养基的灭菌合格，预培养长菌说明本次灭菌失败，需要重新配制灭菌。
培养基的灭菌常见异常处理
灭菌之后培养基不凝固，大概率是 pH 过低或者琼脂降解，长时间高温造成琼脂失效。灭菌之后颜色变深褐，是蔗糖美拉德反应，高温时间过长营养破坏。灭菌之后仍然污染，常见原因冷空气未排净保压时间不足封口破损，或者灭菌锅密封圈老化漏气。
技术总结
培养基的灭菌核心就是饱和蒸汽充分穿透，参数稳定，同时保护热敏组分，重点注意排冷空气控制装量合理保压时间，灭菌之后空白检验是必不可少的质控环节，组培生产批量灭菌的时候，要固定操作流程，定期校验灭菌锅压力表温度传感器，避免设备误差导致培养基的灭菌失效。
【常见问题】
问题：1 培养基的灭菌能不能直接煮沸代替高压蒸汽
回答：1 培养基的灭菌不能只用煮沸代替高压蒸汽，煮沸温度只有一百度，无法杀灭耐热芽孢，后续培养依然会出现杂菌污染，正式实验培养基的灭菌必须使用高压蒸汽灭菌。
问题：2 培养基的灭菌之后为什么还要空白预培养
回答：2 培养基的灭菌之后空白预培养是质控手段，可以检验本次培养基的灭菌是否彻底，如果预培养长出杂菌，代表灭菌失败，提前发现问题避免后续接种全部污染。
问题：3 含有激素的培养基的灭菌可以一起高压吗
回答：3 大部分植物激素属于热敏物质，培养基的灭菌的时候不建议和基础培养基一同高压，高温会让激素降解失效，一般单独过滤除菌，降温后添加到已经完成培养基的灭菌的培养基里面。
问题：4 培养基的灭菌锅内为什么一定要排冷空气
回答：4 培养基的灭菌锅内残留冷空气会造成压力达标但是实际温度偏低，蒸汽热穿透能力下降，最终培养基的灭菌不彻底，排净冷空气是培养基的灭菌关键操作要点。
【免责申明】
本文内容仅作为培养基的灭菌实验操作技术参考，不同类型培养基设备型号存在差异，实际操作严格遵守灭菌设备说明书以及实验室安全规范，本文不构成实验操作绝对保证，因自行操作产生的实验事故损失由使用者自行承担。
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评论列表（4条）
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希望本篇文章《培养基的灭菌 原理与规范操作技术》能对你有所帮助！
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本文概览：培养基的灭菌是微生物组培实验最核心的前置工序，目的是彻底杀灭培养基内部所有微生物，包含细菌真菌芽孢以及休眠孢子，避免杂菌污染后续接种培养，组培苗微生物分离纯化菌种保藏实验都离不开这一步，日常最常用方式是高压蒸汽灭菌，依靠高温高压饱和蒸汽穿透培养基，在短时间内灭活各类微生物，培养基成分复杂，含有蔗糖琼脂维生素激素等热敏物质，如果灭菌参数选择不当，会出现营养成分分解 pH 漂移凝固失败，或者灭菌不彻底仍然长杂菌的问题，培养基的灭菌不是简单加热煮沸，煮沸温度只有一百度，无法杀灭芽孢，所以不能替代高压蒸汽灭菌，操作全程要兼顾灭菌有效性和培养基成分稳定性，配好分装之后要尽快灭菌，长时间放置培养基会滋生杂菌，同时琼脂提前融化变质，影响后续使用效果。